Callum Lynch (Michael Fassbender) ist ein Inhaftierter im Todestrakt. Der Wissenschaftler Joseph bietet ihm jedoch die Möglichkeit, Teil eines außergewöhnlichen Experiments zu sein: Callum wird Proband einer Maschine namens Animus, die es seinen Nutzern ermöglicht, die Erinnerungen ihrer Vorfahren zu durchleben. Zur Zeit der Spanischen Inquisition verkörpert Callum so den Assassinen Aguilar de Agarorobo, Mitglied eines im Schatten operierenden Geheimordens und Sohn eines ihrer größten Anführer. Im Zentrum seiner gelebten Erinnerung steht der Jahrhunderte alte Konflikt der Assassinen gegen die machtlüsternen Templer. In der realen Welt bekommt Callum Unterstützung durch die Assassinin Lara. Der Gegenspieler in der Gegenwart ist Alan Rikkan, CEO und Anführer der modernen Templer, im Spanien des 15. Jahrhunderts ist sein Alter Ego Tomas de Torquemada die ehemalige rechte Hand des korrupten Rodrigo Borgia, der seinerzeit zum Papst aufstieg.
